Новини

Ивермектин (Ivermectin) е инхибитор на репликацията на причинителя на COVID-19 (SARS-CoV-2) in vitro

Ивермектин (Ivermectin)
Ивермектин (Ivermectin)

Акценти

  • Ивермектин (Ivermectin) е инхибитор на вируса, причиняващ COVID-19 (SARS-CoV-2), in vitro
  • Еднократно третиране с Ивермектин е в състояние да намали количеството на вируса в клетъчната култура приблизително 5000 пъти за 48 часа
  • Ивермектин е одобрен от FDA (Агенцията за контрол на храните и лекарствата на Съединените щати) за борба с паразитни инфекции и затова има потенциал за повторната му поява на пазара
  • Ивермектин е широко достъпен благодарение на включването му в списъка на основните лекарства на СЗО (Световната здравна организация)

Теоретични данни

Въпреки че в момента се провеждат няколко клинични проучвания за тестване на възможните терапии с Ивермектин, отговорът на пандемията с COVID-19 в световен мащаб до голяма степен е ограничен до ниво мониторинг/проучване.

Ивермектин, който е одобрен от FDA като антипаразитно лекарство, показва също така широкоспектърна антивирусна активност in vitro и се проявява като инхибитор на вируса SARS-CoV-2.

С еднократно добавяне на Ивермектин към Vero-hSLAM клетки 2 часа след заразяването им със SARS-CoV-2, той е способен да доведе до 5000-кратно намаляване на вирусната РНК за 48 часа. Необходими са допълнителни излседвания на Ивермектин, за да се установят възможните ползи за хората.

Ивермектин е одобрен от FDA като антипаразитен агент с широк спектър на действие, който през последните години, зедно с други групи лекарства  показа in vitro антивирусна активност срещу широк спектър от вируси.

Първоначално е идентифициран като инхибитор на вазимодействието между протеина на интеграза на човешкия имунодефицитен вирус-1 (HIV-1) и хетеродимера на импортина (IMP) α/β1, който е отговорен за ядрения внос на IN6. От тогава е потвърдено, че Ивермектин инхибира IN ядрения внос и HIV-1 размножаването.

Има съобщения, че Ивермектин потиска ядрения внос на гостоприемни и вирусни протеини, включително Големият туморен антиген на simian virus SV40 и неструкторен протеин-5 на вируса на Денга (DENV).

Важно е, че е доказано, че Ивермектин ограничава инфекцията на РНК вируси като DENV-1-4, Западнонилския вирус, Венецуелски вирус на енцефалит по конете (VEEV) и грип, като тази широкоспектърна активност се смята, че се дължи на завизисмостта от много различни РНК вируси върху IMPα/β1 по време на инфекция. Също така е доказано, че Ивермектин е ефективен срещу ДНК-то на псевдораби вируса (PRV), както In vitro, тка и in vivo, като лечението с ивермектин увеличава преживеямостта на мишки, инфектирани с PVR.

Не е наблюдавана ефективност на Ивермектин срещу Zika virus (ZIKV) при мишки, но учените признават, че поради ограниченият брой изследвания е оправдано да се направи повторна оценка на активността на Ивермектин против ZIKV.

За финал трябва да отбележим, че Ивермектин беше в центъра  на клинично изпитание във фаза III в Тайланд през 2014-2017г. срещу DENV инфекция, при което се наблюдаваше, че еднократната дневна перорална доза е безопасна и води до значително намаляване на серумните нива на вирусен протеин NS1, но не са наблюдавани промени във виремията или клиничната полза.

Причинителят на настоящата пандемия COVID-19 (SARS-CoV-2) е едноверижен+ РНК вирус, който е тясно свързан с коронавируса, причинител на тежък остър респираторен синдром (SARS-CoV2). Проучвания на протеина на SARS-CoV разкриват потенциална роля за IMPα/β1 по време на инфекция от сигналозависещо плазмено затваряне на нуклеокапсидния протеин SARS-CoV, което може да повлияе на клетъчното деление. Освен това е показано, че SARS-CoV аксесоарният протеин ORF6 антагонизира антивирусната активност на транскрипционния фактор STAT1 чрез секвестриране на IMPα/β1 върху грубата  мембрана на ER/Golgi. Взети заедно, тези доклади предполагат, че инхибиращата активност на Ивермектин може да бъде ефективна срещу SARS-CoV-2.

За да се тества антивирусната активност на Ивермектин към SARS-CoV-2 са инфектирани Vero/hSLAM клетки със SARS-CoV-2 изолиран Австралия/VIC01/2020 при MOI от 0,1 за 2 часа, последвано от 5 µM Ивермектин. Супернатантните и клетъчни култури бяха събрани в рамките на 3 дни и анализирани с RT-PCR за размножаване на SARS-CoV-2 РНК (фиг.1/А,В). За 24 часа беше регистрирано 93% намаление на вирусната РНК, присъстваща в супернатантните (показателно за освободени вириони) проби, третирани с ивермектин, в сравнение с носителя DMSO. По подобен начин се наблюдава намаление с 99,8% на свързана с клетки вирусна РНК (показателна за неиздадени и непакетирани вариони) при лечение с Ивермектин. След 48 часа този ефект се увеличава с до 5000-кратно намаляване на вирусната РНК при третирани с Ивермектин в сравнение с контролните проби, което показва, че ивермектиновото лечение по същество води до ефективна загуба на целия вирусен материал за 48 часа. В съответствие с тези проучвания, не се наблюдава по-нататъшно намаляване на вирусната РНК след 72 часа. Както вече се видя, не се наблюдава токсичност на Ивермектин при нито една от тестваните точки, нито в ямките за проби, нито паралелно тествани проби само на лекарството.

Ивермектин е мощен инхибитор на клинично изолирания SARS-CoV-2 Австралия/VIC01/2

Фиг. 1: Ивермектин е мощен инхибитор на клинично изолирания SARS-CoV-2 Австралия/VIC01/2020

Клетките Vero/hSLAM са инфектирани с клиничен изолат SARS-CoV-2 Австралия/VIC01-2020 (MOI = 0.1) в продължение на 2 часа преди добавяне на носител (DMSO) или Ивермектин в посочените концентрации.

Пробите са събирани в рамките на 3 дни след заразяване за количествено определяне на вирусна наличност, като се използва PCR в реално време на клетъчно свързан вирус (фиг.1/А) или супернатант (фиг.1/В). IC50 стойностите се определят в последващи експерименти 48 часа след заразяването, като се използват указаните концентрации на Ивермектин (приложен 2 часа след заразяването съгласно фиг.1 А/В).

Трикратния PCR анализ в реално време се провежда върху клетъчно свързан вирус (фиг.1 С/Е) или супернатант (фиг.1 D/F), като се използват сонди срещу гените SARS-CoV-2 E (фиг.1 C/D) или RdRp (фиг.1 E/F). Резултатите представляват средно +/- SD (n=3). Три параметрични криви на отговор на дозата бяха установени с помощта на GraphPad за определяне на стойностите на IC50 (фиг.1 G).

Схематично обяснение за антивирусното действието на Ивермектин срещу коронавирус: IMPα/β1 се свързва с товарния протеин на коронавирус в цитоплазмата (фиг.1 G - отгоре) и го пренася през ядрения порест комплекс (NPC) в ядрото, където комплексът се разпада и вирусният товар може да намали антивирусната реакция на клетката гостоприемник, което води до засилена инфекция.

Ивермектин се свързва и дестабилизира Imp α/β1 хетеродимер, като по този начин предотвратява свързването на Imp α/β1 с вирусния протеин (фиг.1 G - долу) и възпрепятства влизането му в ядрото. Това предполага намалено инхибиране на антивирусните отговори, което води до нормална, по-ефективна антивирусна реакция.

За по-нататъшно определяне на ефективността на Ивермектин, клетките, заразени със SARS-CoV-2 бяха третирани със серийни разреждания на Ивермектин 2 часа след  след инфекцията и супенатантите и клетъчните посявки, събрани за RT-PCR в реално време за 48 часа (фиг.1 C/D). Както по-горе се наблюдава 5000-кратно намаление на вирусната РНК както в супернатантата, така и в клетъчните посявки от проби, третирани с 5 µМ Ивермектин за 48 часа, което се развнява на 99,98% намаление на вирусната РНК в тези проби.

Отново не се наблюдава токсичност на Ивермектин при някоя от тестваните концентрации. IC50 на лечение бе определено да е приблизително 2 µМ при тези условия.

Подчертавайки факта, че анализа наистина открива конкретно SARS-CoV-2, RT-PCR експериментите се повтарят, като се използват за праймери специфични за вирусния RdRp ген (фиг.1 E/F),  а не Е гена, с почти идентични резултати, както за освободен (супернатант), така и за свързан с клетките вирус.

Взети заедно, тези резултати показват, че Ивермектин има антивирусно действие срещу клинично изолиран SARS-CoV-2 in vitro, като една доза може да контролира размножаването на вируса в рамките на 24 – 48 часа.

Предполага се, че това вероятно се случва чрез потискане на IMP α/β1 – медииран яндрен внос на вирусни протеини (фиг.1 G), както е показано за други РНК вируси. Потвърждаването на този механизъм в случай на SARS-CoV-2 и/или компонента (компонентите)  на клетката домакин е важен фокус в бъдещата работа в лабораториите. В крайна сметка, разработването на ефективен антивирусен агент за SARS-CoV-2, който да се даде на пациенти в началото на инфекция, може да помогне за ограничаване на вирусното натоварване, предотвратяване на тежко развитие на болестта и ограничаването на предаването от човек на човек.

Сравнителното тестване на Ивермектин с други потенциални антивирусни средства за SARS-CoV-2 с алтернативни механизми на действие би било важно да се случи колкото е възможно по-скоро.

Този кратък доклад повдига възможността Ивермектин да бъде полезен антивирусен агент за ограничаване на SARS-CoV-2 по подобен начин на тези, за които вече се съобщава. Докато не бъде доказана клиничната им полезност, всички трябва да бъдат изледвани възможно най-бързо.

Ивермектин е доказан като безопасен за употреба от човек и е одобрен от FDA (Американска асоциация по храните и лекарствата) за редица паразитни инфекции. Важно е, че последните прегледи и метаанализи показват, че Ивермектин във висока доза е безопасен като стандартно лечение с ниски дози. Все още няма достатъчно доказателства, за да се направят окончателни заключения за безопасността на Ивермектин по време на бременност.

Най-важната следваща стъпка в по-нататъшната оценка за възможна полза при пациенти със COVID-19 ще бъде изследването на режим на дозиране с множество добавки, който имитира настоящата одобрена употреба на Ивермектин от хора. Както беше споменато Ивермектин беше в центъра на неотдавнашно клинично изпитание на фаза III при пациенти с Денга вирус в Тайланд, което беше установено, че една дневна доза е безопасна, но не доведе до никаква полза. Въпреки това изледователите отбелязват, че може да се разработи подробен режим на дозиране въз основа на фармакокинетични данни. Въпреки че DENV очевидно е много различен от SARS-CoV-2, този подобен дизайн трябва да ни даде информация за бъдещата работа.

Като цяло настоящия доклад, комбиниран с профил на безопасност, че ивермектин е достоен за по-нататъшно разглеждане като възможен антивирусен агент срещу SARS-CoV-2.

Методика

Клетъчни култури, вирусна инфекция и лечение с лекарства

Vero/hSLAM клетките се поддържат в минимална есенциална среда на Earle (EMEM), съдържаща 7% фетален говежди серум (FBS), 2 mM L-глутамин, 1 mM натриев пируват, 1500 mg/L натриев бикарбонат, 15 mM HEPES и 0.4 mg/ml генетицин при 37° С, 5% CO2.

Клетките се посяват в 12-ямкови плаки за тъканна култура 24 часа преди да бъдат заразени със SARS-CoV-2 (Австралия/VIC01/2020 изолат) при MOI 0.1 в инфекциозна среда (според поддържащата среда, но съдържаща само 2% FBS) за 2 ч. Средата, съдържаща инокулум, се отстранява и се заменя с 1 ml свежа среда (2% FBS), съдържаща Ивермектин в посочените концентрации или DMSO самостоятелно и се инкубира, както е посочено за 0 – 3 дни.

В подходящия момент клетъчният супернатант се събира и завърта в продължение на 10 мин при 6 000 g, за да се отстранят остатъците и супернатанта се прехвърли в епруветки за прясно събиране. Клетъчните монослоеве се събират чрез остъргване в 1 ml свежа среда (2% FBS). Контролите на токсичността бяха зададени паралелно във всеки експеримент върху незаразени клетки.

Генериране на SARS-CoV-2 cДНК

РНК се екстрахира от 200 µL аликвоти от супернатанта на пробата или клетъчна суспензия, използвайки QIAamp 96 Virus QIAcube HT Kit (Qiagen, Hiden Германия) и се елуира в 60 µl. Обратна транскрипция се извършва с помощта на комплект BioLine SensiFAST (BioLine, Лондон), обща реакционна смес (20 µl) съсържащ 10 µL екстракт от РНК, 4 µl на 5х буфер TransAmp, 1 µl обратна транскриптаза и 5 µl вода без нуклеаза. Реакциите се инкубират при 25°С за 10 мин, 42 °С за 15 мин и 85 °С за 5 мин.

Откриване на SARS-CoV-2 с помощта на TaqMan RT-PCR анализ в реално време

TaqMan RT-PCR анализ се провежда като се използва  2,5 µl  cDNA, 10 µl праймър тип PrecisonPLUS qPCR Master Mix, 1 μM прав (5'-AAA TTC TAT GGT GGT TGG CAC AAC ATG TT-3 '), 1 μM обратен (5'-TAG GCA TAG CTC TRT CAC AYT T-3 ') праймери и 0.2 μM сонда (5'-FAM-TGG GTT GGG ATT ATC-MGBNFQ-3'), насочени към BetaCoV RdRp (RNA-зависима РНК полимераза) ген или прав (5 ' -ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT -3 '), 1 µM обратен (5'-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A-3') праймери и 0.2 μM сонда (5'-FAM-ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG-286 NFQ-3 ') насочен към BetaCoV E-ген31.

RT-PCR тестове в реално време се извършват на приложена Biosystems ABI 7500 Fast PCR в реално време (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ) при използване на циклични условия от 95 °C за 2 min, 95 °C за 5 сек., 60 °C за 24 сек. Като положителна контрола се използва SARS-CoV-2 cDNA (Ct приблизително 28).

Изчислените стойности на Ct се преобразуват в намаление на кратността на третираните проби в сравнение с контролата по метода ΔCt (кривата се променя във вирусна RNA = 2 €ΔCt) и се изразяват като % от DMSO самостоятелна проба.

Стойностите на IC50 бяха монтирани с помощта на 3 параметрични криви на отговор в дозата в призмата на GraphPad.

Автор(и): LeonCaly, Julian D. Druce, Mike G. Catton, David A. Jans, Kylie M. Wagstaff
Преводач(и): Руси Стоянов
Източник:

ScienceDirect

Коментари